О серебре и, особенно, «наносеребре» не писал только ленивый. И деньги из серебра делали, и «святую воду» держали в серебряных кувшинах, и плесень с бактериями травили наночастицами... Пожалуй, эти факты стали уже почти что классическими... И даже, как мы писали, кровь мексиканских мышей - вампиров не подвергается лизису на наноструктурированных серебряных подложках. Правда, указанное сообщение было датировано 1 апреля, и не случайно... Однако, в каждой шутке есть доля шутки и серебро, правда, может помочь разобраться с кровью. Но не в отношении борьбы с мифическими вампирами, а, уже без шуток, с самой прагматической целью – для создания будущей высокочувствительной биомедицинской диагностики на живых клетках, без их разрушения, возможно, даже на единичных клетках. И это, вероятно, самая интересная и удивительная область применения серебра, требующая именно наночастиц или наноструктур с плазмонным резонансом.
В последнее время разработка новых способов синтеза наночастиц для важнейших биомедицинских приложений, таких как диагностика, визуализация, терапия и доставка лекарств действительно является одним из перспективных направлений современных исследований. Из всех возможных и вполне естественных применений наночастиц и наноструктур на основе серебра самой востребованной является спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). В последние два года количество статей в этом направлении нарастает просто лавинообразно и ГКР начинает рассматриваться как универсальный метод анализа биологических молекул. К основным преимуществам метода относят высокую чувствительность, качественное определение молекул по характеристическим спектрам, простоту пробоподготовки, уникальную возможность усиления сигнала комбинационного рассеяния (КР) до 10^14 раз. Одной из последних тенденций является анализ живых клеток с помощью ГКР-спектроскопии. В этом случае возникает ряд существенных и пока еще не вполне решенных проблем, связанных с поиском эффективных, неинвазивных и воспроизводимых методов исследования, обладающих высокой селективностью и информативностью. В основе метода ГКР лежит эффект плазмонного резонанса, которым обладают наночастицы (НЧ) металлов (например, Ag, Au, Pt) и наноструктурированные материалы на основе ряда металлов, поэтому ключевыми в данной проблеме являются материаловедческие аспекты, то есть, собственно, создание новых ГКР-активных наноматериалов для исследования биомолекул в составе живых клеток.
Серебро является самым востребованным металлом для плазмоники и метода ГКР, поскольку оно имеет большую интенсивность полосы поверхностного плазмонного резонанса (ППР) и обладает высоким коэффициентом экстинкции в максимуме этой полосы. Положение полосы ППР наночастиц серебра можно варьировать в широких пределах от видимой до ближней инфракрасной области путем изменения морфологии и размера частиц, создания их агрегатов и более сложных наноструктур. Контролируемое изменение параметров позволяет «настраивать» НЧ для конкретных задач практического применения, поэтому, с точки зрения химии, ключевую роль играет разработка новых методов синтеза НЧС и наноструктур на их основе с заданными геометрическими параметрами, агрегатной структурой и, соответственно, требуемыми оптическими свойствами.
В последней работе аспирантов и сотрудников Московского Университета, опубликованной в J. Mater. Chem. были получены золи наночастиц серебра, не содержащие органических молекул, поверхностно-активных веществ и стабилизаторов. В предложенном методе используются хорошо известные особенности химии серебра. Образование НЧС может быть описано протеканием следующих реакций: 1) осаждение оксида серебра (I): 2AgNO3 + 2NaOH = Ag2O + 2NaNO3 + H2O, 2) получение аммиачного комплекса: Ag2O + 4NH3 + H2O = 2[Ag(NH3)2]OH, 3) разложение комплекса при нагревании: [Ag(NH3)2]OH ↔ Ag+ + 2NH3 + OH-, 3Ag+ + NH3 + 3OH- =3Ag + ½ N2 + 3H2O. Для создания ГКР-активных материалов был предложен метод разложения [Ag(NH3)2]OH непосредственно на подложках, нагретых до 200 – 270оС с использованием аэрозольного осаждения. Микроструктура наноструктрированных пленок характеризуется наличием типичных элементов в форме пересекающихся концентрических колец, состоящих из металлического серебра. Сложная морфология наноструктурированных пленок серебра обусловлена описанным в литературе эффектом «кофейных колец», который заключается в том, что при высыхании капли частицы располагаются не равномерно по поверхности твердого тела, а концентрируются у границ. В процессе высыхания капиллярный поток, направленный от центра капли к ее границам, переносит взвешенные частицы к краю капли. В ходе испарения концентрация частиц вдоль исходной границы капли растет. Как только образовавшиеся наночастицы перемещаются к границе капли, они формируют неплотно упакованные квазисимметричные структуры вблизи границы кольца. В результате образуется пленка из пересекающихся серебряных колец.
Согласно данным ПЭМ и электронной дифракции, условия получения, такие как температура и время аэрозольного осаждения, играют важную роль в процессе образования наноструктур. При низких температурах (60 оС) образуются кольца, состоящие из не полностью разложившегося Ag2O. Микроструктура таких образцов характеризуется наличием стенок, состоящих из Ag2O и имеющих пористую структуру с относительно небольшим количеством НЧС размером 3 – 30 нм. Электронная дифракция демонстрирует наличие, по крайней мере, двух фаз, включая металлическое серебро и оксид серебра (I). При высоких температурах (270 оС) формируется матрица в виде пористой серебряной структуры («серебряная губка») с включенными в нее «кунжутными зернами».
Такие подложки в течение всего времени съемки спектра с использованием малоинтенсивного лазерного излучения, не повреждающего клетки, сохраняют количество клеток постоянным, то есть с ними не взаимодейстуют убийственно. Кроме того, шероховатые наноструктурированные подложки позволяют иммобилизовать эритроциты, в то время как гладкие стеклянные подложки без нанесенного серебра не могут предотвратить случайных перемещений красных кровяных телец, обусловленных броуновским движением. Эти наблюдения позволяют утверждать, что сигнал ГКР от эритроцитов в случае использования наноструктурированных подложек регистрируется от гемоглобина, находящегося внутри клеток, т.к. число клеток остается постоянным в течение эксперимента и на подложках не происходит разрушения клеток с высвобождением гемоглобина. Иными словами, между наноструктурами серебра и молекулами гемоглобина не возникает прямого контакта: они находятся на расстоянии, равном толщине мембраны (порядка 10 нм). Лазерное излучение с оптимально подобранной мощностью (~0.2 мВт) позволяет сохранить эритроциты в живом состоянии. Если условия получения подложек были фиксированы, то наблюдается хорошая воспроизводимость спектров (~85%). ГКР-исследования изолированного гемоглобина и теней (оболочек) эритроцитов в присутствии наноструктурированных покрытий на основе металлического серебра показали, что ГКР-спектры отвечают колебаниям мембрано – связанного гемоглобина (с внутренней стороны мембраны живого эритроцита).
В случае биомолекул, расположенных внутри клеток, физического контакта между НЧ и аналитом не происходит, в связи с чем доминирующее влияние на механизм усиления КР-сигнала оказывает увеличение локального электромагнитного поля на наноструктурах серебра. Поверхность плазматической мембраны эритроцитов не содержит каких-либо микроворсинок и не покрыта толстым слоем гликокаликса, таким образом, наноструктурные элементы подложки напрямую соприкасаются с плазматической мембраной. И именно полученная “странная” иерархическая структура “кольчужных” пленок серебра является, скорее всего, первопричиной успеха, впервые достигнутого смешанным молодежным коллективом химиков, материаловедов и биологов МГУ.
Дополнительные ссылки:
- А.А.Семенова Наноструктурированные материалы на основе серебра для биомедицинской диагностике методом гигантского комбинационного рассеяния (автореферат диссертации). Автор работы - А.А.Семенова – закончила аспирантуру Факультета Наук о Материалах МГУ.
- Кровь и серебро: Художественное изображение для обложки журнала J. Mater. Chem. (импакт - фактор 5.97 за 2011 год) из статьи A.A.Semenova, E.A.Goodilin, N.A.Brazhe, V.K.Ivanov, A.E. Baranchikov, V.A.Lebedev, A.E.Goldt, O.V.Sosnovtseva, S.V.Savilov, A.V.Egorov, A.R. Brazhe, E.Y.Parshina, O.G.Luneva, G.V.Maksimov, Y.D. Tretyakov, Planar SERS nanostructures with stochastic silver ring morphology for biosensor chips, J. Mater. Chem., 2012, 10.1039/c2jm34686a.
Работа выполнена при поддержке Программы Развития МГУ им. М.В.Ломоносова.
