Вследствие быстрого развития методик синтеза и целенаправленной модификации наноматериалов они все глубже проникают в нишу биотехнологических применений, в том числе и в качестве высокочувствительных сенсоров и "умных" агентов, позволяющих разделять смеси сложных биологических объектов. Среди них – широкое использование наночастиц золота для определения ДНК и белков. Причина этого не только в "сродстве" к тиоловым и дисульфидным группам, приводящем к специфической функционализации золотых наночастиц, что позволяет распознавать биологические объекты, а также приводит к особым оптическим свойствам. Одновременно с этим другой группой перспективных кандидатов для диагностики, терапии и сепарирования являются магнитные наночастицы. В частности, при использовании оксида железа удалось достичь важных достижений в области диагностики и лечения раковых опухолей.
В качестве многофункциональных материалов связанные агрегаты наночастиц, состоящих из золота и оксида железа, обладают уникальными оптическими, супермагнитными и поверхностными свойствами. Таким образом, одним из важных направлений нанобиотехнологии становится направленный синтез таких нанокомпозитов. Среди используемых в настоящий момент путей их синтеза – восстановление Au3+ на поверхности наночастиц Fe3O4, разложение Fe(CO)5 на поверхности Au с последующим и восстановление Au3+на наночастицах Fe3O4, осажденных на ядре кремнезема для формирования трехслойного композита.
Группа ученых из Пекина недавно предложила новый, более простой, способ синтеза таких композитов, основанный на простом связывании двух приготовленных по отдельности материалов. Используемые частицы Fe3O4 были крупнее, чем обычно (до 20 нм), что также увеличивало и магнитный момент таких частиц, требуемый для разделения крупных биомолекул. В ходе исследования активности таких агентов для разделения белков было показано, что они не только высокоэффективны для сепарирования, но также позволяют разделенным белкам сохранять свою ферментную активность. Проведенные исследования не только продемонстрировали более простой синтез композитных частиц золота и оксида железа, но и возможность прямого химического связывания различных наночастиц в более сложные объекты. Итак, что же было сделано?
Синтез наночастиц Fe3O4. Частицы Fe3O4разного размера были приготовлены разными способами. В качестве прекурсора использовали Fe(acac)3 в водном растворе как с добавлением различных ПАВ, так и без них. В дальнейшем использовали аминомодифицированные частицы Fe3O4. Из-за присутствия в растворе 1,6-гексадиамина и его координации с атомами железа на поверхности частиц Fe3O4 также присутствовали аминогруппы. Для того, чтобы в дальнейшем привязать к ним частицы золота, их поверхность была модифицирована с помощью цистеина посредством формирования амидных связей между аминогруппами на поверхности частиц Fe3O4 и карбоксильными группами цистеина. Таким образом, поверхность Fe3O4 была в конечном итоге модифицирована тиоловыми группами.
Синтез наночастиц золота. Наночастицы золота получали восстановлением HAuCl4в водном растворе с помощью NaBH4.
Синтез нанокомпозита Au-Fe3O4. После этого модифицированные частицы Fe3O4 были добавлены к частицам Au, что привело к образованию прочных связей между золотом и тиоловыми группами. После тщательного промывания продукт снова диспергировали в этаноле.
На Рис. 1 схематически изображена стратегия такого синтеза. Кроме того, на Рис. 2 можно наблюдать изменение цветов растворов в процессе синтеза. Исходный раствор Fe3O4 (0.2 мг/мл) черный, а золота (0.01 мг/мл) – красный, тогда как конечный раствор нанокомпозитных частиц – красно-коричневый, откуда следует, что он унаследовал оптические свойства наночастиц золота. Измерение магнитных свойств при 298 К показало отсутствие существенных изменений магнитного момента и коэрцетивной силы исходного Fe3O4 до и после связывания с Au. Различие в 12% между намагниченностью исходного Fe3O4(58 emu/г) и связанного с золотом Au-Fe3O4 (51 emu/г) скорее всего свидетельствует о том, что массовая доля золота и цистеина в композите составляет как раз 12%. Коэрцетивная сила в ходе связывания изменилась со 105 Э в Fe3O4 до 95 в Au-Fe3O4. При прикладывании магнита к стенкам стаканов оба материала в течении нескольких секунд собрались около соответствующей стенки, оставляя раствор прозрачным (Рис. 3).
Морфология продукта была охарактеризована с помощью ПЭМ и РЭМ (Рис. 4). На изображениях видно, что наночастицы Fe3O4 (60 нм) тесно окружены частицами золота (10 нм). ПЭМ высокого разрешения показывает, насколько плотно золото примыкает к оксиду железа. По данным EDAX можно определить содержание Fe, Au, O, C, N, S. Наличие медной сетки и углеродной пасты, а также окисление кислородом воздуха дает дополнительное содержание элементов Cu, C, O. Fe и Au присутствуют в частицах оксида железа и золота, а S и N – в цистеине и аминогруппах. Был проведен контрольный эксперимент, в ходе которого оксид железа не модифицировали предварительно тиольными группами. В ходе этого эксперимента нанокомпозит Au-Fe3O4не образовался, что показывает, что именно связь Au-S ответственна за формирование нанокомпозита.
Для использования этого материала при сепарировании белков к частицам золота нанокомпозитов присоединяли координированный никелем хелат N - [ Na, Na -бис - (карбоксиметил) - L-лизин ] - 16 - меркаптогексадеканамид, образующий с золотом Au-S связь. Присоединенный таким образом никель (Ni2+) может затем образовать последовательно 6 связей с гистидином (6xHis). Таким образом, любой протеин (использовали аргининовую киназу, АК), модифицированный 6xHis, легко может быть отделен этим методом.
Присутствие белка определяли методом металл-хелатной адсорбционной хроматографии. В качестве буферного раствора готовили имидазольный буфер, в качестве индикатора использовали Coomassie Blue G-250, который меняет свою окраску с коричневой на голубую в присутствии белка. После того, как было продемонстрировано выделение белка, с помощью электрофореза установили его чистоту (Рис. 5). Как показывает сравнение второй полоски (исходный протеин) и первой (маркера), исходный белок содержит частицы разного размера. Это распределение по размерам сохраняется и в выделенном белке (полоска 3). В результате промывания (полоски 4, 5, 6) видно, что белок действительно удаляется полностью.
Для проверки практической значимости использования указанного приема была проведена проверка каталитических способностей выделенного белка АК в магний-зависимой обратимой фосфореляции L-аргинина аденозинтрифосфатом. Принимая активность фермента за 100%, можно считать, что концентрация его составила 0.05 мг на 100 мг наночастиц. Кроме того, важно отметить, что в ходе выделения наночастицы не разрушаются и могут быть использованы повторно.
